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miRNA mimics

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    miRNA mimi-10nmol 10nmol 650.00 650.00 期货
    miRNA mimi-5nmol 5nmol 400.00 400.00 期货

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miRNA mimics:涵盖了miRBase13.0数据库中人、小鼠和大鼠几乎所有的miRNA,运用化学合成的方法,模拟生物体内源的miRNA,特异性增强内源性miRNA的功能。同时本本公司还可以为客户提供不同长度、不同形式,由客户自行设计的miRNA。

产品简介
miRNA mimic 是miRNA 模拟物,化学合成的成熟miRNA 双链,产品为冻干粉形式的即用型试剂;
miRNA inhibitor 是miRNA 抑制物,化学修饰的成熟miRNA 互补单链,产品为冻干粉形式的即用型试剂;
miRNA agomir 是特殊化学修饰的miRNA 激动剂,适用于细胞实验、动物实验,产品为冻干粉形式的即用型试剂;
miRNA antagomir 是特殊化学修饰的miRNA 拮抗剂,适用于细胞实验、动物实验,产品为冻干粉形式的即用型试剂
运输保存
产品以冻干粉的形式常温运输。收到产品后,请于-20℃~-80℃保存,冻干粉可以稳定保存一年。

使用前瞬时离心,用RNase-free H2O 或灭菌ddH2O 配制成20μM 储存液,分装保存,避免反复冻融(建议不超过5 次)。

使用须知:
1) miRNA 产品呈很轻的干膜状附在管壁上,打开管子前先离心,然后再慢慢打开管盖,溶解时请加足量RNase-free
H2O 或灭菌ddH2O 后盖上管盖,震荡溶解。
2) 为避免外界因素(包括酶,极端 pH 或者温度条件等)导致产品降解,所有操作请严格遵循RNA 操作规则。实验过
程中,产品最好于冰上放置,使用完毕后请于-20℃~-80℃小心保存。

细胞实验方法:
为了降低细胞密度、试剂用量,转染效率等因素导致的孔间差异,保证实验的可靠性和可重复性,Biomics 建议:
1) 转染实验中每个转染样品至少设置3 个复孔;
2) 接种细胞时,每孔接种的细胞数量尽量保持一致,尽量使细胞在各孔的表面平均分布。
1. 转染浓度:
1) 为了获得最佳基因阻断结果,每一种细胞系转染miRNA 的量都需要经过实验确定。如果您是首次转染您的细胞系,
推荐尝试使用几个LipofectamineTM 2000 的浓度,并在20-100nM 范围内改变miRNA 的浓度,以确定达到最佳基因
阻断水平所需要的条件。高浓度的miRNA 可能具有细胞系依赖性。
2) 在30-50%细胞汇合度时进行转染。通常基因沉默分析至少要在转染后24-72 小时进行。低密度转染细胞可以使转
染和分析之间更长的间隙更长,从而使由于细胞过度生长造成的细胞活性损害减少到最低。根据靶基因的特性,高
密度转染的细胞可能更加适合条件的优化。
3) 不要在转染时的培养基中加入抗生素,因为这将会降低细胞转染的效率和导致细胞死亡。
4) 为了获得更好的结果,可以使用Invitrogen 的Opti-MEM 低血清培养基在形成复合物前稀释LipofectamineTM 2000
和miRNA。 可以使用荧光标记的miRNA 帮助优化细胞系的转染条件。一旦确定了用来转染的最佳条件,可以在
每一次实验都包括荧光标记miRNA,作为转染效率的指示剂.
注:miRNA inhibitor 往往需要用到较大的用量才能观察到较好的抑制效果,相当于miRNA mimic 的几倍用量,
这可能与miRNA inhibitor 竞争性抑制的作用机制及作用效率有关。因此,当使用推荐的转染浓度没有获得预期效
果时,可适当选择更高的浓度(表3 )或选择antagomir(无需转染试剂)进行实验.
2. 转染步骤:
以LipofectamineTM 2000 转染miRNA 于24 孔板,转染浓度为50nM 为例,其他规格容器转染请参考表2。
1) 接种细胞
贴壁细胞:转染前24 hrs,在400 μL 无抗培养基中接种0.5 - 2×105 个细胞,转染时细胞融合度为30 - 50%。
(注:铺板时要将细胞消化完全混匀,避免细胞堆积生长。)
悬浮细胞:转染前24 hrs,在400 μL 无抗培养基中接种0.5 - 2×105 个细胞,转染时细胞数量应在4 - 8
×105/孔。
2) 转染步骤
A. 用50 μL Opti-MEM 稀释miRNA (转染细胞的终浓度为50 nM) ,轻轻吹吸3 - 5 次混匀。
B. 轻轻颠倒混匀转染试剂,用50μL Opti-MEM 稀释1.0 μL LipofectamineTM 2000,轻轻吹吸3 – 5 次混匀,室
温下静置5 min。
C. 混合转染试剂和miRNA 稀释液,轻轻吹吸3 - 5 次混匀,室温下静置20 min。
D. 转染复合物加入到24 孔细胞板中,100 μL/孔,前后轻摇细胞板混合均匀。
E. 细胞板置于37℃、5% CO2 培养箱中培养18 - 48 hrs。转染4 - 6 hrs 后可换新鲜培养基表

 3) 效果检测:
miRNA agomir 和antagomir 作用效果往往通过功能方面检测,转染完成后2 4 ~ 7 2 小时均可进行检测,最佳检测
时间与细胞类型及研究的miRNA 有关。以下为几种常用的miRNA 效果检测方法:
a) 使用qPCR,基因芯片,新一代测序等方法检测靶基因mRNA 转录水平,甚至全基因表达图谱是否发生相应改变;
b) 使用Western Blot,蛋白芯片等方法检测靶基因的蛋白水平是否发生相应改变;
c) 检测细胞功能(细胞增殖、细胞凋亡、细胞迁移等)是否发生相应变化;
d) 通过靶基因siRNA 来确认miRNA mimic/inhibitor 的作用;
e) 通过与miRNA 靶基因双荧光素酶报告载体(Biomics 可提供构建服务)共转来验证miRNA mimic/inhibitor 的

作用

动物实验:
Biomics 提供动物实验用的各种修饰miRNA 产品及脂质体包载RNA 制剂服务。
1. miRNA 动物实验的体内环境复杂,实验周期长,对miRNA 产品的稳定性提出了更高的要求。
2. m i R N A 动物实验方法主要分为两类,局部作用和全身作用。Biomics 推荐采用稳定性更好、可靠性更高的化学
修饰miRNA agomir 和antagomir 进行动物实验或脂质体包载的方式,具体方案需要依据实验目的及条件而定

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